PCR: Reazione a catena della polimerasi

La reazione a catena della polimerasi è una tecnica di biologia molecolare molto utilizzata in laboratorio per avere rapidamente tante copie di tratti di DNA di particolare interesse, che possono essere dei geni. Questo processo è portato avanti da una DNA-polimerasi che sintetizza un nuovo filamento di DNA a partire di desossiribonucleotidi trifosfati (dNTP) e  due inneschi di DNA detti primers, complementari alle estremità 5′ dei due filamenti del tratto da amplificare. La reazione avviene in un termociclatore (thermocycler) che esegue automaticamente i passaggi di temperatura necessari per la PCR. La DNA-polimerasi utilizzata è una Taq polimerasi (proveniente dal batterio Thermus aquaticus) la cui caratteristica principale è quella di non essere inattivata dalle alte temperature.

Per avviare la reazione il DNA deve essere denaturato, cioè il doppio filamento si deve separare e dare due filamenti singoli (per rottura dei ponti a idrogeno tra le basi azotate), ciò è possibile aumentando la temperatura a circa 94-95 °C; questa è detta fase di denaturazione. La fase successiva è detta di annealing, in cui la temperatura viene abbassata a 40-50 °C (a secondo dei primers utilizzati) per permettere ai primers di appaiarsi alle regioni a loro complementari nel DNA a singolo filamento, regioni che si trovano a monte e a valle del tratto di interesse. Da ultimo, durante la fase di allungamento, la Taq polimerasi sintetizza il DNA allungando i primers e utilizzando come “mattoncini” i dNTP e come stampo il filamento singolo di DNA. Questi tre  passaggi si ripetono più volte (almeno una trentina) in modo da avere un’amplificazione adeguata del prodotto di interesse. Oltre i quaranta cicli di PCR è bene non andare perchè la Taq polimerasi essendo priva dell’attività di proofreading, ovvero di correzione del filamento neo sintetizzato, rischia probabilisticamente di inserire una base sbagliata e quindi che venga amplificato un tratto che contiene una mutazione puntiforme. La reazione viene sempre svolta aggiungendo alla soluzione un Buffer (tampone) che serve per mantenere il pH stabile necessario per costituire l’ambiente adatto.

Nel disegno uno schema della reazione a catena della polimerasi (Google Immagini)

Per ottenere il primo prodotto di interesse a doppio filamento ci vogliono tre cicli di PCR, dopo il terzo ciclo la reazione procede secondo una curva esponenziale.

Fonti:

  • “Antropologia molecolare” di David Caramelli; edizione Firenze University Press;
  • “La PCR e le sue varianti” di Scialpi Angela e Mengoni Alessio; edizione Firenze University Press.
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2 risposte a PCR: Reazione a catena della polimerasi

  1. Martina ha detto:

    eh eh eh ….mi suona familiare, anche se nn dovrebbe!!! =)

  2. Manuela Kiko ha detto:

    Aaah, la vecchia cara PCR…

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